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红杏短视频app下载精品无码 知识分享丨常见的高通量测序DNA文库构建的方法

发布时间:2023-06-12
本文介绍三种常见的用于高通量测序(NGS)的DNA文库构建方法:接头连接建库,转座酶建库,PCR扩增子建库。

本文介绍三 种常 见的用 于高通量测序(NGS)的DNA文库构建方法: 接头连接建库,转座酶建库,PCR扩增子建库。




连接接头建库

接接头建库是目前市 场上应用比较广泛的技术,其建库方式已经很成熟。


基本过程是: 首先通过物理打断或酶切打断的方式将提取好的基因组DNA片段化,片段化后的DNA末端需要进行补平修复和加A,再在DNA连接酶的作用下,再连接上接头,最后通过PCR扩增,中间再穿插着纯化/分选步骤就完成了文库的构建。


优点: 末修连接法建库可以有效保留样本几乎所有基因组信息,非常有利于未知拷贝数和基因组变异的检测,是全基因组测序和外显子测序的主要建库手段。


缺点: 建库过程中步骤相对较多,中间还穿插了多次的磁珠纯化,繁琐步骤容易造成误差。





转座酶建库

转座酶建库技术的关键是Tn5转座子,Tn5转座子是一种细菌转座子,本质是一段含有若干抗性基因和编辑转座酶基因的DNA片段。将Tn5用于文库构建时,可将DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为一步反应,大大缩短建库时间。Tn5用于建库的体外转座要素包含:转座子的末端序列、靶DNA、转座酶(Tnp)和Mg2+。

优点:

1.转座子用于测序文库构建时,将DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为1步反应,极大缩短建库时间,提高工作效率。

2.文库构建的DNA投入量低至1ng,甚至是100pg,对于珍贵的样本或者临床上低核酸含量的样本有很好的使用体验。


缺点:

1.对DNA的纯度和DNA浓度准确性要求较高,否则会影响打断的效果。

2.与传统的连接接头建库相比,单个反应的成本较高。





PCR扩增子建库
PCR扩增子建库是指利用PCR反应在待测DNA片段两端加上接头的方法,原理相对比较简单,只需要两轮PCR和两步纯化就可以得到目标区域的文库,其中第一步是含通用序列的引物与目标区域结合,第二步通过PCR反应连接测序接头,使得构建的文库可以用于上机测序。

PCR扩增子建库流程


优点:

1.PCR扩增子建库通过定制引物Panel完成文库构建。PCR扩增子建库方法具有临床应用性,可以针对疾病目标基因进行捕获,提高目标基因检测的覆盖度和测序深度,解释临床结果。

2.PCR扩增子方法建库可以通过单次测序反应检测更多患者样本,大大减少后期生信分析的任务,获得的数据更易于储存和管理。


缺点:

1.PCR扩增子建库应用于全外显子或全基因组建库时,由于设计出的引物不能完全扩增出所有的待测片段会导致最终的文库覆盖率较低。

2.当扩增子之间有重叠时,为了避免重叠部分产生的短扩增子的优势扩增的影响,需要有两个或多个引物池,这样就会导致试验流程复杂且增加成本。

3.应用在mNGS检测上,需要对致病菌有提前的预判,也违背了mNGS检测无偏倚性的初衷,同时如果引物Panel设计的不够全面,容易出现漏检的情况。

4.多重PCR反应中容易出现引物二聚体的积累,引物二聚体的扩增会大量消耗引物本身和体系中其他的原料,甚至有抑制所需DNA序列扩增的效果。


东盛生物建库试剂 盒工作流程图


东盛生物针对Illumina和MGI测序平台开发了多款NGS文库构建试剂盒,包括 普通建库试剂盒,酶切建库试剂盒,快速建库试剂盒,以及配套的接头引物 ,可以快速、高效构建NGS文库,兼容多种样本类型以及PCR-free工作流程,对低起始量的样本也具有很高的建库效率,保证测序工作的顺利和成功。





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