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红杏视频入口影视app RT-kit(逆转录试剂盒)(R1011-R1012)

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红杏视频入口影视app RT-kit(逆转录试剂盒)(R1011-R1012)

价格: 220.00~920.00
运费 ¥0.00
R1011 (20次) R1012 (100次)

RT-PCR Kit (逆转录试剂盒)

产品说明

RT-PCR Kit( 逆转录试剂盒)是专为两步法 RT-PCR 第一步实验配制的、具有高灵敏度的 RT-PCR 反应系统。该系统合理配备了与 cDNA 第一链合成反应相关的各种组分,优化的体系保证了 M-MLV 具有高效的逆转录酶活性,所得 cDNA 对后续的 PCR 或定量 PCR 实验兼容性好,可用于检测稀有基因的表达、从极少数细胞中定量检测特定 mRNA 的表达水平、克隆特定基因的 cDNA 片段等。

M-MLV 逆转录酶是由一个 71 kD 的单亚基组成的重组型 DNA 逆转录聚合酶。可以催化以 RNA DNA RNA 杂交链为模板的互补 DNA 的聚合反应。本酶经修饰 RNase H 活性比普通的逆转录酶要弱很多,因此在合成第一链 cDNA 的过程中,可保证 RNA 的降解程度较低,从而使得率提高。

产品组分

货号

R1011 20 次)

R1012 100 次)

M-MLV 200U/µl

20 μl

100 μl

RNasin 40U/µl

12 μl

60 μl

Oligo d(T)15 Primer 50 μM

20 μl

100 μl

Random primer 50 μM

20 μl

100 μl

5xfirst-strand buffer

80 μl

400 μl

RNase-free ddH2O

1 ml

1 ml×5

dNTPs(10mM each)

50 μl

250 μl

R1011 可进行 20 次逆转录反应 ,R1012 可进行 100 次逆转录反应( 20 μl 标准 PCR 反应体系,每次使用  M-MLV 1μl )。

M-MLV 储存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

5xfirst-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

质量检测

逆转录酶活性检测

使用 [32P]dCTP 作为标记, 200 U  M-MLV 1μg 1.2 kb RNA 为模板进逆转录反应,最低可得到 120ng cDNA ,所得 cDNA 长度  > 全长的 90%

核酸外切酶活性检测

混合 50ng 的标记 DNA RNA 200U M-MLV 反应缓冲液体系中, 37℃ 温浴 1 h ,检测 DNA RNA 降解都不到总量的 1%

适用范围

第一链 cDNA 合成

cDNA 文库构建

RT-PCR

引物延伸

3' 5' RACE

注意事项

l 成功的 cDNA 合成来自高质量的 RNA 。高质量的 RNA 至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂,如 EDTA  SDS 。用于 cDNA 合成反应的溶液试剂尽可能用 DEPC 进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。

l 为了增加贮存 RNA 样品的稳定性,可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中,存于 -70℃ 。用于保存  RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时,可以使用下列方法沉淀 RNA :加入 NaCl 0.2 M 同时加入 4 倍体积的乙醇,室温放置 3-5 min 10,000 rpm 离心 5 min

l 在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂( RNasin )以增加 cDNA 合成的长度和产量。在第一链合成反应中, RNase 抑制剂在缓冲液和还原剂(如  DTT )存在的条件下加入,因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放出 RNase 。但是 RNase 抑制剂仅防止 RNase A B C RNA 的降解,并不能防止皮肤上的 RNase ,因此尽管使用了 RNase 抑制剂,也要小心不要从手指上引入 RNase

l 较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开,增加反应的产量。

l 使用简单的 RNA 纯化方法即可获得满足 RT-PCR 反应的 RNA ,但为了保证实验的成功率,建议使用 GTC 法(异硫氰酸胍法)制备的高纯度 RNA

l 为防止 RNA 降解,应尽量避免反复冻融,最好保存于 -70℃

l 最佳的 PCR 反应条件,因 PCR 扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先试做一下 control 反应,以确定最佳的 PCR 反应条件。

l cDNA 产物应置于 -20℃ 保存。

l 当以 cDNA 为模板进行 PCR 之前,使用 RNase H 处理 cDNA ,可以提高 PCR 反应的灵敏度。

操作步骤

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)15 Random primer

RNase-free ddH2O 13.4μl

2 进行变性退火反应

70℃ 温浴 5 min,

简短离心后冰浴 5 min

3 在上述离心管中配制反转录反应液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs 10 mM each

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV

4 按下列条件进行反转录反应

Oligo (dT)15 42℃ 温浴 60 min

Random primer  37℃ 温浴 60 min

5 终止反应

70℃ 温浴 5 min 终止反应,置冰上进行后续实验或 -20℃ 保存。

6 RNase-free ddH2O 将反应体系稀释到 50μl ,取 2-5μl 进行 PCR 扩增反应。


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